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本文作者：蘇嵐1，曾令兵1,2周勇2張輝2高正勇2張金鳳2作者單位：1華中農(nóng)業(yè)大學水產(chǎn)學院2中國水產(chǎn)科學研究院長江水產(chǎn)研究所

材料與方法

1實驗材料與試劑

草魚呼腸孤病毒GCRV-104株，由本實驗室分離鑒定和保存;草魚腎臟組織細胞系，由本實驗室建立與保藏［12］;大腸桿菌菌株DH5α、克隆載體pCR1、酵母表達載體pPICZB、畢赤酵母KM71菌株均購于Invitrogen公司。各種限制性內(nèi)切酶和DNA連接酶購自Promega公司;TaqDNA聚合酶、10×PCRBuffer、dNTPs、DNAmarker為TaKaRa公司產(chǎn)品;瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒及酵母DNA提取試劑盒為OMEGABio-Tek公司產(chǎn)品;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和ZeocinTM購自Invitrogen公司;蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標準購自Fermentas公司;一抗:鼠抗草魚呼腸孤病毒104株VP6蛋白多抗由本實驗室制備;二抗:羊抗鼠IgG-HRP為ABCLONAL公司產(chǎn)品。

2VP6基因的PCR引物設計及擴增

根據(jù)GeneBank公布的GCRV-104株VP6基因編碼序列(HM234682)和酵母表達載體pPICZB所含的酶切位點，應用軟件Premier5設計一對特異擴增引物:P1:5''''-CggAATTCATggCACgTgTggTT-TAT-3'''';P2:5''''-TCCCCgCgggTgTggTTACgCgggTCAg-3''''，分別引入EcoRⅠ、SacⅡ酶切位點。CIK細胞培養(yǎng)和GCRV增殖按參考文獻進行［13］。按TrizolReagent說明書提取病毒總RNA，通過逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)擴增VP6基因。PCR反應條件如下:95℃預變性5min;94℃變性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min30s，30個循環(huán);最后72℃延伸10min。擴增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳后回收純化，克隆到pCR1載體，經(jīng)酶切、PCR和測序鑒定的重組質(zhì)粒命名為pCR1-VP6，經(jīng)轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α篩選鑒定后，含陽性重組質(zhì)粒的大腸桿菌命名為pCR1-VP6/DH5α。

3酵母表達載體的構(gòu)建

用質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒從大腸桿菌pCR1-VP6/DH5α中提取質(zhì)粒，重組質(zhì)粒和酵母表達載體pPICZB分別用EcoRⅠ和SacⅡ雙酶切，回收的VP6基因片段與載體片段在T4DNA連接酶的作用下過夜連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，在25μg/mLZeocin的抗性平板上篩選陽性克隆。提取質(zhì)粒，以酵母特異AOXⅠ引物:FP:5''''-GACTG-GTTCCAATTGACAAGC-3'''';RP:5''''-GCAAATGGC-ATTCTGACATCC-3''''，進行PCR鑒定，同時進行酶切鑒定和測序分析。經(jīng)鑒定的重組質(zhì)粒命名為pPICZB-VP6，含陽性重組質(zhì)粒的大腸桿菌命名為pPICZB-VP6/DH5α。

4電轉(zhuǎn)酵母菌及轉(zhuǎn)化子的篩選

重組質(zhì)粒pPICZB-VP6經(jīng)SacⅠ線性化，同時酶切空載體pPICZB做對照，異丙醇沉淀回收。酵母感受態(tài)細胞的制備和電擊轉(zhuǎn)化法參考EasySelectPichiaexpressionkitusermanual，Invitrogen。經(jīng)電擊轉(zhuǎn)化入酵母KM71，電擊后的菌液涂布在Zeocin濃度分別為0.5、1.0、0、3.0、4.0、5.0mg/mL的YPDS平板上，30℃培養(yǎng)2～4d。挑取在高濃度Zeocin平板上生長良好的轉(zhuǎn)化子采用PCR方法篩選陽性轉(zhuǎn)化子，反應條件同1.2，擴增結(jié)束后進行1.0%的瓊脂糖電泳分析。

5重組酵母菌的誘導表達及產(chǎn)物鑒定

挑取陽性轉(zhuǎn)化子接種到25mLBMGY培養(yǎng)基中，30℃、250r/min培養(yǎng)至OD600值至6左右，離心收菌，重懸于5mLBMMY培養(yǎng)基，封瓶膜封口。30℃、250r/min的條件下誘導培養(yǎng)，每24h補加100%的甲醇至終濃度0.5%(V/V)，設置電轉(zhuǎn)空載體的pPICZB/KM71菌株作為對照。誘導72h后，取菌液1mL，離心收集菌體用滅菌雙蒸水洗滌2次，加入蝸牛酶等滲溶液100μL(48mg蝸牛酶溶解于100μL5.48%的山梨醇溶液)，同時加入10μLβ巰基乙醇，37℃孵育1h，使酵母細胞壁破裂。離心后取裂解液上清、沉淀懸浮液(50μLPBS懸浮)以及對照裂解液進行SDS-PAGE電泳檢測。同時以常規(guī)方法進行Western-blotting反應［14］，一抗?jié)舛葹?∶2000，辣根過氧化物酶標記的二抗?jié)舛葹?∶20000，化學發(fā)光底物顯色。

結(jié)果與分析

1VP6基因的PCR擴增結(jié)果

以提取的GCRV104病毒總RNA為模板，用合成的特異擴增引物P1、P2進行RT-PCR擴增，經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳，可見一條大小約1300bp的特異性條帶，與預期大小(VP61319bp)一致，如圖1。對pCR1-VP6重組質(zhì)粒進行PCR、酶切，并送測序，測序結(jié)果與GeneBank(HM234682)上的參考序列一致，表明成功克隆了GCRVVP6編碼基因。

2pPICZB-VP6重組表達載體的構(gòu)建與鑒定

將擴增的GCRVVP6編碼基因克隆到酵母表達載體，構(gòu)建了重組酵母表達質(zhì)粒pPICZB-VP6，經(jīng)SacⅡ單酶切后得到大小約為4600bp的片段;經(jīng)EcoRⅠ、SacⅡ雙酶切后得到大小分別為1300bp和3300bp的片段，與預期酶解片段大小一致;以酵母AOXⅠ引物進行PCR擴增得到大小約1600bp的片段(pPICZB載體上、下游引物之間序列長度與目的片段長度之和)，如圖2。測序結(jié)果與GeneBank公布的GCRVVP6基因參考序列一致，說明目的基因已正確克隆到酵母表達載體中。

3轉(zhuǎn)化酵母菌及轉(zhuǎn)化子的鑒定

重組酵母質(zhì)粒pPICZB-VP6經(jīng)SacⅠ線性化(圖3)后轉(zhuǎn)化到酵母KM71菌株，在Zeocin平板上篩選高拷貝轉(zhuǎn)化子，以酵母AOXⅠ引物進行PCR鑒定，結(jié)果顯示陽性轉(zhuǎn)化子擴增出一條大小約1.6kb的特異條帶，與重組質(zhì)粒擴增的結(jié)果一致，而空質(zhì)粒只擴增出一條300bp的條帶(圖3)，表明VP6基因已整合到畢赤酵母基因組中。測序結(jié)果如圖4，表明重組到酵母基因組的VP6基因序列正確，并且酵母表達載體上的多聚組氨酸(6×His)標簽和VP6在一個閱讀框內(nèi)，終止密碼子TGA位于His標簽后。

4表達產(chǎn)物的SDS-PAGE和Western-Blotting檢測

對經(jīng)甲醇連續(xù)誘導72h的酵母培養(yǎng)物經(jīng)離心和破壁處理，進行SDS-PAGE電泳檢測，結(jié)果顯示誘導后重組菌株的裂解上清在46000處有一特異蛋白條帶，與GCRV天然VP6蛋白的分子量相符(圖5A);對照菌株中則無該條帶;誘導后重組菌株的沉淀懸浮液顯示弱的蛋白條帶。Western-Blot檢測結(jié)果如圖5B，重組酵母菌株表達的GCRVVP6蛋白可與鼠抗草魚呼腸孤病毒VP6的多抗特異性結(jié)合，在46000處出現(xiàn)單一雜交條帶;而裂解后的細胞沉淀、對照菌株則無雜交條帶，確證了表達產(chǎn)物是GCRVVP6蛋白。

討論

當GCRVVP6蛋白在大腸桿菌系統(tǒng)中高效表達時，通常以不溶的包涵體形式存在，后期的溶解、復性過程耗時費力，且復性率低;而利用桿狀病毒、昆蟲細胞表達系統(tǒng)表達時操作復雜、表達水平低、產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)昂貴。所以本實驗研究了VP6蛋白在畢赤酵母系統(tǒng)中的表達情況。另一方面，酵母獨特的細胞壁和微體(microbody)結(jié)構(gòu)，可以為在其中表達的外源蛋白提供一種生物微囊，使其免受消化道蛋白酶的降解［15］。本實驗的誘導表達條件為30℃、0.5%的甲醇添加量、72h，是根據(jù)增強綠色熒光蛋白(EGFP)在畢赤酵母中的表達情況初步確定的。本實驗室曾將EGFP基因整合到酵母表達載體pPICZB多克隆位點區(qū)的EcoRⅠ和SacⅡ酶切位點間，并成功實現(xiàn)了其在酵母宿主菌KM71中的表達，通過流式細胞儀分析表明在30℃、0.5%甲醇添加量的條件下，誘導24h時重組菌株開始表達，誘導72h時重組酵母的表達量最高，為提高VP6蛋白在畢赤酵母中的表達水平可以進一步對溫度、pH、OD值、甲醇添加量等條件進行優(yōu)化。Batra等［16］成功在酵母胞內(nèi)載體pPICZA中表達了登革病毒2型包膜蛋白結(jié)構(gòu)域Ⅲ(EDVⅢ)，其蛋白表達量可達到50mg/L，并將此重組酵母添加到飼料中通過口服途徑免疫小鼠，結(jié)果誘導產(chǎn)生了高效價的中和抗體。Jha等［17］將WSSV的包膜蛋白VP19和VP28在畢赤酵母中表達后以口服的形式免疫小龍蝦，免疫組獲得了大于60%的免疫保護率。本實驗利用基因工程技術(shù)，將GCRVVP6抗原蛋白基因整合到高效表達的畢赤酵母中，成功實現(xiàn)了VP6蛋白在酵母菌中的表達，但重組酵母工程菌的表達量及其對魚體的免疫效果，還有待于下一步的魚體實驗。采用疫苗免疫的方法是預防草魚出血病最為有效的途徑之一［18］。目前用于防治草魚出血病疫苗多采用浸泡和注射途徑給予，不僅操作繁瑣，而且引起魚體應激反應?？诜且环N最自然的免疫途徑，給藥安全、方便，使用不受時間、地點和魚體大小限制，對水生動物不引起應激反應［19］。近年來，隨著對魚類黏膜免疫系統(tǒng)，尤其是口服免疫應答機理的認識不斷增加，為口服疫苗的研制提供了理論基礎。開展酵母載體表達草魚呼腸孤病毒抗原蛋白技術(shù)的研究，可為草魚出血病口服疫苗的制備提供新的思路。