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本文作者：王彥、孟祥晨、王麗群、李馨單位：東北農(nóng)業(yè)大學乳品科學教育部重點試驗室

雙歧桿菌是人和動物腸道最常見的革蘭氏陽性有益細菌,約占人體腸道可培養(yǎng)微生物的10%。雙歧桿菌屬的微生物是應(yīng)用較多的益生菌之一,在食品中通常通過添加于乳制品進行食用消費。研究表明,雙歧桿菌可以通過平衡腸道菌群維持機體的整體健康水平。雙歧桿菌經(jīng)食用進入體內(nèi),發(fā)揮益生功能的先決條件是其在腸道的黏附與定植,例如黏附能夠縮短痢疾持續(xù)時間[1],刺激免疫應(yīng)答[23],競爭排斥病原微生物[4]等,因此,黏附腸道能力是篩選益生菌的一個重要標準。雙歧桿菌被攝食后,在未達到腸道前會經(jīng)歷胃的酸性環(huán)境,而人體胃液的酸度很強,通常的pH為3.0,空腹或食用酸性食品時可達1.5,食用堿性食物時可達4.05.0[5],雙歧桿菌經(jīng)歷該酸性環(huán)境后,其黏附作用會受何影響還不清楚。因此,本文將主要探討不同pH的酸性環(huán)境對雙歧桿菌黏附能力的影響。由于體內(nèi)實驗實施困難,體外細胞培養(yǎng),尤其是人結(jié)腸癌細胞系Caco-2細胞,可作為模型用于分析菌株的黏附[67]。另外,有研究表明雙歧桿菌的黏附能力與細菌表面組成及結(jié)構(gòu)直接相關(guān),所以菌體表面的物理化學性質(zhì)也可以間接反應(yīng)菌體的黏附能力,菌體細胞表面的物理化學特征主要取決于其表面疏水性和自動聚集能力,Pan等[8]通過對23株雙歧桿菌疏水性和黏附能力進行比較分析,建立了能夠反映雙歧桿菌表面疏水性與黏附性之間關(guān)系的回歸方程(R2=0.78),疏水性越強的菌株黏附能力越強。王麗群等[9]測定了7株雙歧桿菌表面疏水性和自動聚集能力,同時觀察了雙歧桿菌的黏附能力,結(jié)果表明,雙歧桿菌的黏附能力、自動聚集能力及表面疏水性具有一定的正相關(guān)性。因此,在評價低pH處理對菌株黏附性影響時,本研究同時確定對菌體自動聚集能力和表面疏水性的影響。

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1試驗菌種:兩歧雙歧桿菌KLDS2.0603分離自成人糞便,由乳品科學教育部重點實驗室凍干保藏。

1.1.2供試細胞:Caco-2(Humancolonadenocar-cinoma,人結(jié)腸腺癌細胞),其特征是能夠體外模擬成熟上皮細胞的結(jié)構(gòu)和功能特征,購自中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫。

1.2實驗方法

1.2.1細胞培養(yǎng):從液氮罐中取出Caco-2細胞,將凍存管迅速置于37°C水浴中復(fù)蘇細胞,離心收集細胞后,加入4mL含10%胎牛血清(使用前56°C滅活30min)的DMEM培養(yǎng)基,在37°C、5%CO295%空氣的條件下培養(yǎng),每隔一天更換培養(yǎng)液;當細胞在培養(yǎng)瓶底長至80%時,需進行傳代。用于黏附測定的Caco-2細胞,單層細胞培養(yǎng)于預(yù)先放有玻璃蓋玻片的六孔培養(yǎng)皿,接種量為1×105CFU/mL,每隔48h及進行黏附試驗前24h更換一次培養(yǎng)基,維持細胞生長。單層細胞培養(yǎng)1517d,后期融合后,即可用于黏附試驗。

1.2.2菌種的活化與傳代:兩歧雙歧桿菌KLDS2.0603接入mMRS液體培養(yǎng)基,37°C條件下厭氧(80%N2、10%H2、10%CO2,下同)培養(yǎng)48h;在mMRS固體培養(yǎng)基上劃線,37°C條件下厭氧培養(yǎng)48h,鏡檢后挑取固體培養(yǎng)基中形態(tài)良好,沒有雜菌的菌落,接入mMRS液體培養(yǎng)基中,37°C條件下厭氧培養(yǎng)48h,經(jīng)過兩代液體培養(yǎng)以提高菌株活力。

1.2.3雙歧桿菌經(jīng)不同pH的PBS溶液處理后存活率的測定:將生長至對數(shù)生長期后期的細菌培養(yǎng)物8000g離心10min,收集菌體,菌體經(jīng)PBS(pH7.2)清洗兩遍后重懸于pH為1.03.0(以0.5為梯度)的PBS中,37°C分別孵育0.5、1.0、1.5和2.0h,然后采用平板計數(shù)法測定其活菌數(shù),分別計為An,經(jīng)PBS處理前的活菌數(shù)計為A0,存活率(%)表示為:An-1/A0×100。同時以pH為7.0的PBS處理作對照。確定存活率變化最大的時間點為處理時間。

1.2.4不同pH的PBS溶液對雙歧桿菌的處理:將生長至對數(shù)生長期后期的細菌培養(yǎng)物8000g離心10min,收集菌體,菌體經(jīng)PBS(pH7.2)清洗兩遍后重懸于pH為1.05.0(以0.5為梯度)的PBS中于37°C處理0.5h,8000g離心10min,收集菌體,經(jīng)PBS(pH7.2)清洗兩遍后,收集菌體,再進行后續(xù)實驗。同時以pH為7.0的PBS處理作對照。1.2.5雙歧桿菌黏附性的測定:(1)直接鏡檢法測定雙歧桿菌的黏附能力。參考Gopal等[10]的方法,采用直接鏡檢法測定雙歧桿菌的黏附能力,具體步驟如下:將菌體濃度調(diào)整為1×108個細胞/mL,經(jīng)PBS溶液處理后重懸于DMEM培養(yǎng)基,用于黏附測定。Caco-2細胞用PBS(pH7.2)清洗后,添加2mL含雙歧桿菌的DMEM培養(yǎng)基,于37°C、5%CO2-95%空氣條件下孵育1h。單層細胞用無菌PBS緩沖液清洗5次,甲醇固定10min,革蘭氏染色,在顯微鏡油鏡下觀察細菌與細胞的黏附狀態(tài)。黏附能力以隨機選取的20個顯微視野進行評價,并以100個Caco-2細胞黏附的細菌數(shù)表示。(2)平板菌落計數(shù)法測定雙歧桿菌的黏附率。參考Kos等[11]的方法,采用平板菌落計數(shù)法測定雙歧桿菌的黏附能力,具體步驟如下:將菌體濃度調(diào)整為1×108個細胞/mL,經(jīng)PBS溶液處理后重懸于DMEM培養(yǎng)基,用于黏附測定。Caco-2細胞用PBS(pH7.2)清洗后,添加2mL含雙歧桿菌的DMEM培養(yǎng)基,37°C、5%CO2-95%空氣條件下,培養(yǎng)1h。單層細胞用無菌PBS(pH7.2)緩沖液清洗5次,以除去未黏附的細菌細胞,加入250μLTrypsine-EDTA(0.05%Tryp-sine,0.53mmol/LEDTA)于37°C培養(yǎng)15min,將黏附的細菌從細胞上釋放下來。然后向每個孔中添加250μL含10%胎牛血清的DMEM以終止胰酶活力,用吸管將Caco-2細胞層裂解下來。黏附細菌經(jīng)10倍系列稀釋后涂布于mMRS平板,做平行對照,37°C厭氧培養(yǎng),活菌數(shù)計為A1,黏附前的活菌數(shù)計為A0。黏附率(%)表示為:A1/A0×100。

1.2.6雙歧桿菌疏水性的測定:通過實驗菌株對碳氫化合物的親和力反映菌株表面疏水性,具體參考Rosenberg等[12]的方法,步驟如下:將PBS溶液處理后的菌體,用PBS緩沖液在600nm處調(diào)節(jié)吸光值為0.80.9(準確讀取其吸光度值,記作A0)。取3mL該菌液,然后加入0.6mL十六烷。該兩相體系通過渦旋振蕩徹底混合2min,37°C共孵育1h后去除上清液,于600nm處測定水相的吸光值(記作A)。按如下公式計算實驗菌株的疏水性[H(%)]:H(%)=[(A0A)/A0]×100,這里A0和A分別表示有機溶劑萃取前后的吸光值。進行3次獨立的試驗。

1.2.7雙歧桿菌自動聚集能力的測定:菌株的自動聚集能力以自動聚集百分比表示,具體參考Collado等[13]的方法,方法如下:將PBS溶液處理后的菌體重懸于耗盡的mMRS培養(yǎng)基中,經(jīng)漩渦振蕩2min后,取1mL測定細菌懸浮液在600nm處的吸光值作為整個細菌懸浮液的吸光值,而后25°C靜止放置120min后,取1mL上層清液至另一試管中,在600nm處測其吸光值,通過以下公式計算自動聚集百分比:1(上層清液吸光值/整個細菌懸浮液吸光值)×100。

1.3數(shù)據(jù)處理所有實驗均重復(fù)3次,運用SPSSStatisticsV17.0軟件,采用獨立樣本t檢驗進行數(shù)據(jù)分析(P<0.05),試驗結(jié)果用平均值±標準偏差表示。

2結(jié)果與分析

2.1不同pH的PBS溶液處理后雙歧桿菌的存活率兩歧雙歧桿菌KLDS2.0603經(jīng)不同pH的PBS溶液處理不同時間后,分別測定其存活率,結(jié)果見圖。由圖1可知:兩歧雙歧桿菌KLDS2.0603在pH為1.0和1.5的PBS中處理0.5h后,已經(jīng)無法檢測到活菌;在pH為2.0的PBS中處理0.5h后,活菌數(shù)僅為6.85×104CFU/mL,并隨處理時間的延長活菌數(shù)逐漸下降,處理1.5h后幾乎檢測不到活菌;在pH為2.5的PBS溶液中處理0.5h后存活率為52.35%,并隨處理時間的延長活菌數(shù)逐漸下降;在pH3.0的PBS溶液中,在處理的2.0h內(nèi),活菌數(shù)并無明顯變化。綜合上述結(jié)果,確定兩歧雙歧桿菌KLDS2.0603在不同pH的PBS溶液中的處理時間為0.5h時存活率變化最大。

2.2不同pH的PBS溶液處理對雙歧桿菌黏附性的影響

2.2.1采用直接鏡檢法獲得的結(jié)果:采用直接鏡檢法測定經(jīng)不同pH的PBS溶液處理后,兩歧雙歧桿菌KLDS2.0603的黏附能力,結(jié)果如圖2所示。由圖2可知:兩歧雙歧桿菌KLDS2.0603在pH7.0時的黏附性為260.90個/100個細胞;除pH5.0的處理組外,其余各組的黏附性均顯著低于對照組(P<0.05);pH1.5(黏附性為119.05個/100個細胞)和pH2.5(黏附性為111.02個/100個細胞)兩處理組的黏附能力最低,且顯著低于其余各處理組(P<0.05)。由圖1的結(jié)果可知:在pH為1.0和1.5條件下處理0.5h后,已經(jīng)檢測不到活菌,但此時仍有細菌黏附,說明死菌體也具有一定的黏附能力。

2.2.2采用平板菌落計數(shù)法獲得的結(jié)果:由于直接鏡檢法無法區(qū)分黏附的死菌體和活菌體,因此采用平板菌落計數(shù)法測定黏附的活菌體數(shù)量。圖3給出的是經(jīng)不同pH的PBS溶液處理后,兩歧雙歧桿菌KLDS2.0603的黏附能力。由圖3可知:對照處理組(pH7.0)的黏附率最大,除pH5.0的處理組外,其余各處理組的黏附率均顯著低于對照組(P<0.05)。在pH為1.02.0的范圍內(nèi)未檢測到活菌,其黏附率為0;在pH為2.53.5的范圍內(nèi),隨pH升高,黏附率下降;在pH為4.05.0的范圍內(nèi),隨pH升高,黏附率逐漸升高。

2.3不同pH的PBS溶液處理對雙歧桿菌疏水性的影響圖4是兩歧雙歧桿菌KLDS2.0603經(jīng)不同pH的PBS溶液處理后的表面疏水性。由圖4可知:兩歧雙歧桿菌KLDS2.0603在pH7.0時的疏水性為77.16%;pH3.0(疏水性為88.69%)和pH3.5(疏水性為89.84%)兩處理組的疏水性顯著高于對照組(P<0.05),其余處理組與對照組無顯著差異。2.4不同pH的PBS溶液處理對雙歧桿菌自動聚集能力的影響圖5是兩歧雙歧桿菌KLDS2.0603經(jīng)不同pH的PBS溶液處理后的自動聚集能力。由圖5可知:除pH1.0、1.5和5.0處理組外,其余各組均顯著低于對照組(pH7.0);在pH為1.03.0范圍內(nèi),隨pH的升高,自動聚集能力逐漸降低;在pH為3.55.0范圍內(nèi),隨pH的升高,自動聚集能力逐漸升高。

3討論

由于益生菌到達人體腸道發(fā)揮益生作用前,會經(jīng)歷胃酸等酸性環(huán)境[5],較低的酸性環(huán)境會對益生菌的存活造成一定影響,已有的研究表明[1415],雙歧桿菌的耐酸性具有種屬特異性,不同雙歧桿菌的脅迫致死pH不同。Liu等[16]用pH2.0的PBS來測定38株雙歧桿菌的存活率,發(fā)現(xiàn)處理90min時幾乎無存活,由本試驗可以看出當pH降低到3.0以下時,會對雙歧桿菌的存活造成顯著影響(圖1)。這些酸性環(huán)境也可能會進一步影響益生菌在人體內(nèi)的定植和其益生作用的發(fā)揮。本試驗以高黏附能力菌株兩歧雙歧桿菌KLDS2.0603為研究對象,針對不同pH的酸性環(huán)境對兩歧雙歧桿菌KLDS2.0603黏附的影響進行研究,以Caco-2細胞為模型,采用平板菌落計數(shù)法和直接鏡檢法對雙歧桿菌的黏附能力進行測定。結(jié)果表明,經(jīng)不同pH酸處理后的兩歧雙歧桿菌KLDS2.0603黏附能力下降。經(jīng)非致死的酸性條件處理后,隨pH的增加,兩歧雙歧桿菌KLDS2.0603黏附能力逐漸升高(圖2、3)。經(jīng)致死酸性條件處理后,黏附率有所下降,可能由活菌數(shù)下降所導(dǎo)致(圖2),同時實驗證實,酸處理的致死菌株也具有一定的黏附能力(圖3)。本研究證實酸性環(huán)境影響了實驗菌株的黏附性,這種影響是不利的。許多報道指出,黏附是一個復(fù)雜的多步的過程,黏附過程分為非特異性結(jié)合階段和特異性黏附階段,非特異性結(jié)合是益生菌與細胞的黏附過程中乳酸菌產(chǎn)生的胞外多糖(EPS)起作用[17];特異性結(jié)合是黏附素與黏附素受體之間的特異性結(jié)合,有研究表明益生菌的膜蛋白和脂磷壁酸(LTA)介導(dǎo)乳酸菌與腸上皮細胞的特異性黏附[3,1819]。益生菌在低pH處理后膜脂質(zhì)會發(fā)生相應(yīng)變化[20],同時產(chǎn)生相應(yīng)的酸應(yīng)激蛋白[21],可能會使菌體表面的黏附素發(fā)生變化,從而降低了菌體的黏附作用。此外,疏水作用被認為是影響細菌與宿主間反應(yīng)的因素之一,與多種黏附現(xiàn)象,如組織表面的黏附、塑料表面的黏附、細菌間的集聚等均有關(guān)。細菌的疏水性源于菌體表面靜電荷、極性和非極性殘基的相對分布。雙歧桿菌表面疏水性和自動聚集能力通常被認為是兩個獨立的、能夠反映雙歧桿菌黏附能力的特征[22]。本研究同時對雙歧桿菌表面疏水性和自動聚集能力進行測定,分析酸處理后雙歧桿菌表面性質(zhì)和黏附能力之間的相關(guān)性。研究證實,除pH為3.5處理組外,兩歧雙歧桿菌KLDS2.0603的表面疏水性和黏附能力呈現(xiàn)很好的正相關(guān)性;除pH3.0的處理組外,兩歧雙歧桿菌KLDS2.0603的自動聚集能力和黏附能力呈現(xiàn)較好的正相關(guān)性。對于pH為3.0和3.5處理組所呈現(xiàn)的非正相關(guān)性,分析原因可能在于pH3.0和3.5是致死pH向非致死pH的過度,pH對菌體表面靜電荷的影響不同,或不同程度上改變了菌體表面極性和非極性殘基的相對分布,但這些因素的改變是否是引起黏附能力改變的主要因素,還有待進一步的證實。