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本文作者：王航、孟春、石賢愛、郭養(yǎng)浩單位：福州大學生物科學與工程學院、福建省醫(yī)療器械和醫(yī)藥技術重點實驗室

2-苯乙醇(2-Phenylethanol,PEA)是一種具有玫瑰香味的高級醇,香味淡雅細膩,香氣輕柔甜和,在醫(yī)藥、食品、化妝品、煙草和日化用品等行業(yè)逐漸得到廣泛應用,成為芳香族化合物中最重要的香料品種。天然PEA香味純正,無不良副產(chǎn)物,日益受到消費者青睞,其市場價格遠高于化學合成的PEA[1]。利用酵母催化L-苯丙氨酸(L-Phe)生成PEA是工業(yè)化生產(chǎn)天然PEA的有效途徑。目標產(chǎn)物PEA對酵母的抑制效應遠大于副產(chǎn)物乙醇,是PEA生物合成過程主要瓶頸。了解PEA對酵母的脅迫機制及酵母的抵抗機理有助于深化對酵母合成PEA過程的認識,為解除PEA抑制效應提供依據(jù)。有機溶劑對酵母細胞作用位點眾多,細胞對環(huán)境脅迫作用的抵抗機制也十分復雜,至今仍未完全弄清楚。醇對酵母脅迫的研究多集中于乙醇,對PEA的研究較少見。流式細胞術可在單細胞水平對群體細胞進行分析,具有分析速度快、靈敏度高、測量指標多、信息量大等優(yōu)點,是進行細胞生理生化特性研究的有力工具。利用流式細胞術對PEA作用后酵母細胞生理生化特性變化進行研究,未見相關報道。本文研究在不同濃度PEA作用下,酵母分解代謝能力、細胞形態(tài)、細胞膜滲透性、胞內(nèi)ROS濃度、線粒體膜電位、關鍵酶基因的表達等生理生化特性的變化規(guī)律,為優(yōu)化PEA生物合成過程提供重要依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌種:釀酒酵母R-UV3由本實驗室選育[2]。1.1.2主要儀器:熒光定量PCR儀(ABIPrism7500),AppliedBiosystems公司;透射電鏡(JEM1010),JEOL公司;流式細胞儀(CoulterEpicsXL),BechmanCoulter公司;冷凍離心機(Z323K),Hermle公司。1.1.3主要試劑:碘化丙啶、羅丹明123和二氫乙啶(98%),Sigma公司;TRIZOL試劑,美國Invitrogen公司;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒,TaKaRa公司;熒光定量PCR試劑盒(SYBRGreen),AppliedBiosystems公司。1.1.4培養(yǎng)基:①種子培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖20.0,蛋白胨20.0,酵母浸粉10.0,pH5.0;②糖代謝測試培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖10.0,KH2PO41.0,脲2.0,MgSO40.3,CaCl20.2,pH5.0;③分批轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖60.0,KH2PO41.0,脲1.0,L-Phe10.0,MgSO40.3,CaCl20.2,pH5.0。

1.2方法

1.2.1種子培養(yǎng):從斜面接種至裝有25mL種子培養(yǎng)基的250mL搖瓶中,30°C下250r/min振蕩培養(yǎng)1214h至對數(shù)期。

1.2.2酵母PEA處理方法:收集對數(shù)期酵母種子,以0.6%(干重)接種量接入裝有25mL分批轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基的250mL搖瓶中,30°C、250r/min振蕩培養(yǎng)18h,離心收集菌體,無菌水洗滌2次后,轉(zhuǎn)接入裝有25mL含PEA培養(yǎng)基的250mL搖瓶中,每小時補加0.25g葡萄糖溶液(50%,W/W),30°C、250r/min培養(yǎng)24h。

1.2.3糖代謝保留值測定:見文獻[2]。

1.2.4碘化丙啶染色:離心收集經(jīng)PEA處理24h的酵母細胞,用PBS洗滌2次后稀釋至107個細胞/mL,取100μL細胞加1μL2.5mg/L的碘化丙啶,37°C避光孵育50min,加900μLPBS,混勻,流式細胞儀檢測(激發(fā)光488nm,FL3檢測器測605635nm發(fā)射光強度),計數(shù)10000個細胞。

1.2.5二氫乙啶染色:離心收集經(jīng)PEA處理24h的酵母細胞,用PBS洗滌2次后稀釋至107個細胞/mL,取100μL細胞加900μL含0.01%十四烷基三甲基溴銨的PBS和1μL30mg/L的二氫乙啶,37°C避光孵育30min,流式細胞儀檢測(激發(fā)光488nm,FL3檢測器測605635nm發(fā)射光強度),計數(shù)10000個細胞。1.2.6羅丹明123染色:離心收集經(jīng)PEA處理24h的酵母細胞,用PBS洗滌兩次后稀釋至107個細胞/mL,取100μL細胞加900μLPBS和2μL1mg/L的羅丹明123,37°C避光孵育20min,流式細胞儀檢測(激發(fā)光488nm,FL1檢測器測505545nm發(fā)射光強度),計數(shù)10000個細胞。

1.2.7透射電鏡觀察:離心收集經(jīng)PEA處理24h的酵母細胞,每107個細胞加入1mL的4%多聚甲醛和2.5%戊二醛固定液,4°C下固定3d后,委托福建醫(yī)科大學電鏡實驗室制成50nm薄切片,使用透射電鏡進行觀察,電壓80kV。

1.2.8aro10基因相對表達量檢測:取1mL酵母細胞(約108個),離心去上清,加入1mL1%蝸牛酶液和20μL5%二硫蘇糖醇溶液,37°C振蕩脫壁30min。4°C、1000×g離心10min去除上清液,加入1mLTRIZOL試劑,按文獻[3]提取RNA。按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將提取到的RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。利用SYBRGreen試劑盒進行實時熒光定量PCR檢測,PCR引物見表1。PCR反應參數(shù)設置見表2。每個樣品做4個重復樣,以actin為內(nèi)對照,ΔCt=aro10的平均Ct–actin的平均Ct;以不加L-Phe組為陰性對照,ΔΔCt=樣品組ΔCt–不加L-Phe組ΔCt,以2ΔΔCt表征aro10基因的相對表達量。

2結(jié)果與討論

2.1PEA對酵母糖代謝活性的影響分解代謝是細胞生理活動的基礎。酵母細胞的糖代謝活性可表征其生理生化狀態(tài)及生物活性。測定了外加不同濃度PEA作用24h后酵母的糖代謝保留值,結(jié)果見圖1。酵母糖代謝保留值隨PEA濃度增加而降低,在PEA濃度超過2.4g/L后,下降趨勢變得更加顯著,PEA濃度大于3.0g/L后,下降趨勢又有所趨緩。在4.0g/LPEA作用后,糖代謝保留值仍有0.43,說明此時酵母還未完全死亡,仍有分解代謝能力。

2.2PEA對酵母細胞形態(tài)的影響酵母分別經(jīng)0、2.7和4.0g/LPEA作用24h后,切片做透射電鏡觀察(圖2)。圖2A是未經(jīng)處理的酵母細胞,其細胞壁與細胞質(zhì)界限清晰,內(nèi)部結(jié)構完好可見,外形圓滑。圖2B是經(jīng)2.7g/LPEA作用的酵母細胞,與圖2A所觀察到的細胞無明顯差別。圖2C和2D是經(jīng)4.0g/LPEA作用的酵母細胞,細胞內(nèi)部結(jié)構變得模糊不清,細胞質(zhì)染色明顯變淺,可能是因為細胞膜滲透性增強,胞內(nèi)物質(zhì)大量外漏。

2.3PEA對細胞膜滲透性的影響細胞膜是隔離胞內(nèi)外物質(zhì)的天然屏障,細胞膜滲透性的增強會導致胞內(nèi)重要物質(zhì)泄露,從而使細胞失去活性[4]。以碘化丙啶(Propidiumiodide,PI)為染色劑,用流式細胞儀測定了經(jīng)不同濃度PEA作用24h后細胞膜滲透性的變化,結(jié)果見圖3。由圖3可知,當外加PEA濃度小于0.8g/L時,絕大多數(shù)酵母細胞的熒光值小于1,未被PI滲透,說明絕大多數(shù)細胞的細胞膜完好。隨著外加PEA濃度增加,熒光值大于1的細胞越來越多,說明越來越多細胞的細胞膜受到破壞。特別是當外加PEA濃度由2.4g/L增加到3.0g/L,被PI滲透的酵母明顯增加,而且熒光值較高的細胞也明顯增多,說明細胞膜受損的程度明顯加大。當PEA濃度大于3.0g/L后,在較弱的熒光區(qū)域分化出一個小峰,說明細胞群體產(chǎn)生了分化。

2.4PEA對細胞內(nèi)ROS水平的影響活性氧簇(Reactiveoxygenspecies,ROS)是細胞代謝的副產(chǎn)物。ROS濃度過高,會氧化核酸、蛋白質(zhì)、脂肪等生物大分子,使其失去生物功能,從而抑制細胞活性。當細胞受到環(huán)境脅迫時,可能產(chǎn)生大量的ROS,從而誘導細胞凋亡[5]。以氫乙啶(Dihydroethidium,DHE)為染色劑,用流式細胞儀測定了經(jīng)不同濃度PEA作用24h后細胞內(nèi)ROS水平,結(jié)果見圖4。由圖4可知,隨著PEA濃度增加,產(chǎn)生較強熒光的細胞數(shù)逐漸增加,同時峰形也向熒光值高的方向偏移,說明越來越多細胞的ROS濃度增加了。PEA濃度從1.6g/L增加到2.4g/L時,ROS急劇增加,PEA超過3.0g/L后,ROS濃度反而下降,這可能是由于細胞受到越來越大的傷害,產(chǎn)生ROS的能力反而下降。

2.5PEA對線粒體膜的影響線粒體是真核細胞中的重要細胞器,在細胞凋亡過程中起重要作用。線粒體功能在增強酵母細胞對乙醇耐受性上起十分重要的作用[6]。以羅丹明123(Rhodamine123,RH123)為探針,用流式細胞儀測定經(jīng)不同濃度PEA作用后酵母細胞線粒體膜電位,結(jié)果見圖5。由圖5可知,隨著PEA濃度增加,在熒光值較高區(qū)域逐漸出現(xiàn)新細胞峰,峰的數(shù)量也逐漸增多,說明細胞種群呈分化趨勢,特別是PEA超過3.0g/L后,出現(xiàn)了幾個熒光值較高的峰,細胞種群明顯分化。當PEA度超過3.5g/L后,高熒光值細胞急劇增多,說明大量細胞線粒體膜電位顯著增大。線粒體膜電位增大說明泵出線粒體膜的質(zhì)子多于流回基質(zhì)的質(zhì)子,而質(zhì)子的泵出在分解代謝過程產(chǎn)生,質(zhì)子的流入由合成代謝介導,因而線粒體膜電位增大反映分解代謝水平超過合成代謝,二者解偶聯(lián)。Stark等[7]觀察到隨著外加PEA濃度的升高,細胞比耗氧速率增加,而細胞對糖得率卻下降,從動力學角度為PEA導致細胞分解代謝和合成代謝解偶聯(lián)提供了證據(jù)。許多研究表明,細胞線粒體膜電位升高往往導致ROS濃度升高[8]。

2.6PEA對aro10基因表達的影響苯丙酮酸脫羧酶是L-Phe生成PEA途徑中的關鍵酶之一,aro10是釀酒酵母中編碼苯丙酮酸脫羧酶的主要基因[9]。將酵母細胞在含1%L-Phe的PEA培養(yǎng)基培養(yǎng)3h后,測定aro10基因相對表達量,結(jié)果見圖6。PEA的加入降低了aro10的表達,在PEA濃度達到2.4g/L后表達水平急劇下降,PEA濃度超過3.0g/L,aro10的表達逐漸回到不加L-Phe的水平。aro10相對表達量隨外加PEA濃度的變化關系與qPhe隨PEA濃度的變化趨勢[10]很相似,可見,PEA抑制L-Phe轉(zhuǎn)化的重要機理之一,是PEA抑制aro10基因的轉(zhuǎn)錄。由于苯丙酮酸脫羧酶受L-Phe誘導,因而PEA導致aro10基因表達水平下降的原因可能是PEA抑制了L-Phe的攝入。綜上,當PEA濃度由2.4g/L增加到3.0g/L,R-UV3酵母的分解代謝能力、細胞膜滲透性、aro10基因表達水平等生理生化特性都發(fā)生較為顯著的變化,從而導致生物轉(zhuǎn)化活性急劇下降[10]。從補料分批轉(zhuǎn)化過程[10]來看,當反應液中PEA濃度超過3.0g/L后,PEA的增長明顯變慢,也印證了這一敏感區(qū)間的存在。PEA對酵母細胞作用規(guī)律的研究結(jié)果不僅具有理論意義,而且對實施產(chǎn)物原位轉(zhuǎn)移(InSituProductRemoval,ISPR)過程中水相PEA濃度控制具有實際指導作用。在ISPR過程中,通過有效控制水相PEA濃度,可令酵母細胞保持較大的催化活性,從而提高時空得率。根據(jù)本文研究結(jié)果,ISPR過程水相PEA濃度可考慮控制在2.43.0g/L。